蛋白表达与检测
提供从高灵敏度检测到空间定位分析的全套方案，精准量化目标蛋白的表达水平。
Yeast Two-Hybrid
酵母双杂交技术（Yeast Two-Hybrid, Y2H）是基于真核生物转录因子结构域分离与重构原理，在酵母细胞内研究蛋白质间相互作用的经典分子生物学方法。该技术突破了体外互作检测（如 Pull-Down）无法模拟细胞内生理环境的局限，可在活细胞中直接验证蛋白互作，兼具高特异性、高灵敏度、操作简便且成本可控的特点。Y2H 技术不仅能验证已知蛋白间的相互作用，还可通过cDNA文库筛选诱饵蛋白的未知互作搭档，广泛应用于信号通路调控、蛋白复合物组成解析、疾病相关分子机制研究等领域。相较于免疫共沉淀（Co-IP），Y2H 无需纯化蛋白或特异性抗体，能快速筛选大量潜在互作蛋白，是蛋白质相互作用网络研究中高效的筛选与验证工具。
原理介绍
的核心原理是，利用真核生物转录因子（如 GAL4），其N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。利用蛋白间的相互作用使 BD 与 AD 重构，激活下游报告基因表达，通过报告基因表型验证互作关系。
文献案例
《Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology》上发表了题为“Hepatocyte Stress Increases Expression of YAP and TAZ and Promotes Fibrosis Through a Yes-Associated Protein-Transcriptional Enhanced Associate Domain–Dependent Mechanism” 的研究论文。该研究旨在探究肝细胞应激如何通过Hippo通路关键效应子YAP/TAZ驱动肝纤维化。研究人员推测，在应激的肝细胞中，被激活的YAP蛋白可能需要与特定的转录辅因子结合，才能启动促纤维化基因程序。为了系统地寻找YAP在肝脏中的新型相互作用伙伴，他们采用了酵母双杂交筛选这一经典方法。研究团队以人类YAP蛋白的全长序列为“诱饵”，筛选了一个商业化的人类肝脏cDNA文库。经过多轮严格的筛选与验证，他们成功鉴定出转录增强子关联结构域蛋白家族成员——TEAD4，是与YAP发生强相互作用的猎物蛋白之一。这一发现至关重要，因为它将肝细胞内的应激信号与已知的、控制细胞增殖的YAP-TEAD转录复合物直接联系了起来。后续的细胞内验证（如免疫共沉淀）证实了该互作在哺乳动物细胞中的存在。功能实验进一步表明，在肝细胞特异性敲除TEAD4的小鼠中，由药物诱导的肝纤维化程度显著减轻。该研究清晰地展示了酵母双杂交技术如何作为“发现引擎”，从一个关键的“诱饵”蛋白出发，锁定其直接互作的“猎物”蛋白，从而揭示出YAP-TEAD4这一对相互作用在传导肝细胞应激信号、驱动肝纤维化进程中的核心作用，为治疗肝纤维化提供了新的潜在靶点。
送样标准
序列需提供 FASTA 格式文件；重组质粒浓度≥500ng/μL，体积≥50μL，-20℃保存，冰袋运输；需附带测序报告
要求同诱饵蛋白载体，若为 cDNA 文库需提供文库浓度（≥100ng/μL）、库容及插入片段长度信息
需提供 Y2HGold、AH109 等合格菌株，-80℃甘油冻存，干冰运输；需注明菌株基因型及筛选标记
＞1g / 份，液氮速冻后 - 80℃保存，干冰运输；需明确组织类型及处理条件（如胁迫处理、发育阶段）
交付内容
自激活与毒性检测报告
诱饵蛋白自激活检测结果（培养基生长状态、显色情况）、毒性验证结果（菌落生长状态描述）；
共转化与筛选结果报告
各对照组与实验组在不同缺陷型培养基上的生长照片、显色照片，明确互作阳性 / 阴性判定结论；
技术支持文档
提供实验优化建议（如自激活去除、毒性缓解方法）、假阳性 / 假阴性排除指南，若为文库筛选则提供潜在互作蛋白的基因序列及功能注释报告。
常见问题
①蛋白间相互作用较弱，可延长四缺陷培养基的培养时间至 5-7 天，或降低培养基中 3-AT 的浓度；②诱饵蛋白与猎物蛋白在酵母细胞内未正确表达，通过 Western Blot 验证融合蛋白表达情况，优化载体构建策略；③互作依赖特定翻译后修饰（如磷酸化），酵母细胞无法提供该修饰，需结合体外 Pull-Down 实验进一步验证；④载体共转化效率低，优化转化条件（如调整 PEG 浓度、孵育时间）。
①回转验证：将筛选获得的猎物蛋白载体与诱饵蛋白载体重新共转化酵母，验证互作重复性；②体外验证：通过 Pull-Down 实验，使用纯化的重组蛋白验证直接相互作用；③体内验证：利用 Co-IP、双荧光素酶互补等技术，在植物或动物细胞中验证生理条件下的互作关系。
