蛋白表达与检测
提供从高灵敏度检测到空间定位分析的全套方案，精准量化目标蛋白的表达水平。
Western blot
蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）是分子生物学、生物化学及临床医学领域中最常用的蛋白分析技术之一，核心用于检测样品中特定蛋白质的表达水平、分子量验证及蛋白修饰（如磷酸化、乙酰化）分析。其凭借高特异性、高灵敏度的优势，成为蛋白表达研究中不可或缺的核心手段。 WB技术广泛应用于基础科研与临床检测：基础研究中可用于验证基因表达产物、分析蛋白相互作用、探究信号通路激活状态；临床场景中可辅助肿瘤标志物检测、病原体筛查、疾病分型诊断等。相较于其他蛋白检测技术，WB能同时实现蛋白定性与半定量分析，为科研结论与临床诊断提供可靠的实验依据，被誉为蛋白表达分析的“黄金标准”。
原理介绍
WB实验核心基于抗原与抗体的特异性结合原理，借助凝胶电泳的分离特性与信号放大技术，实现对目标蛋白的定性、半定量分析及分子量验证，核心原理如下：目标蛋白作为抗原，具有独特的抗原决定簇，可与针对该位点的特异性一抗发生高度专一性结合，形成抗原-一抗复合物。为实现信号可视化，需加入标记二抗，二抗可特异性识别并结合一抗的恒定区，构建“目标蛋白-一抗-二抗”的三级复合物体系。 二抗通常标记有酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶）或荧光基团，标记物可通过特定反应产生可检测信号——酶标记二抗可催化化学发光底物（如ECL）产生荧光信号，荧光标记二抗可直接发出特定波长荧光。通过检测信号的有无、强弱及位置，即可判断目标蛋白是否存在、表达水平高低及分子量大小，为蛋白相关研究提供精准依据。
文献案例
《cell death & disease》发表题为“Role of the PI3K/AKT signaling pathway in the cellular response to Tumor Treating Fields (TTFields)”的论文。研究以人胶质母细胞瘤U87细胞为研究模型，设置对照组、TTFields单独处理组及PI3K抑制剂联合TTFields处理组，经对应处理后提取各组细胞总蛋白，采用WB技术检测PI3K/AKT通路关键蛋白及自噬、凋亡相关蛋白的表达水平。结果显示，TTFields单独处理可显著下调细胞中磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化AKT（p-AKT）及下游mTOR蛋白的表达，同时上调自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I比值及凋亡相关蛋白Caspase-3的活化水平。而PI3K抑制剂联合TTFields处理后，上述蛋白表达变化更显著，p-AKT表达水平进一步降低，细胞凋亡率明显升高，提示抑制PI3K/AKT通路可增强肿瘤细胞对TTFields的敏感性。该研究通过WB技术精准验证了PI3K/AKT通路的活性状态与肿瘤细胞对TTFields的响应密切相关，为通过靶向PI3K/AKT通路提升TTFields治疗效果提供了明确实验支撑，也凸显了WB技术在肿瘤治疗机制研究中的核心价值。
送样标准
浓度≥500ng/μL，体积≥50μL，-20℃保存，冰袋运输；需附带测序报告及载体图谱
新鲜叶片 / 愈伤组织＞1g / 份，4℃冷藏运输，24h 内送达；需注明植物品种及生长状态
细胞系需提供活力＞90% 的冻存细胞，干冰运输；原生质体需新鲜制备，冰袋运输，12h 内送达；需注明细胞类型及培养条件
诱饵蛋白 / 猎物蛋白基因序列（FASTA 格式），需明确酶切位点及融合方向
交付内容
原始实验数据
WB实验原始显影图（包括目的蛋白、内参蛋白条带）、灰度值定量原始数据、电泳与转印参数记录。
数据分析报告
目的蛋白分子量验证结果、灰度值分析统计图（目的蛋白/内参蛋白灰度比值）、蛋白表达水平半定量结论、实验结果解读。
常见问题
①蛋白样品降解，需在提取过程中添加足量蛋白酶抑制剂，全程低温操作；②凝胶浓度不适，可根据目标蛋白分子量调整凝胶浓度（小分子蛋白用高浓度凝胶，大分子用低浓度凝胶）；③上样量过多，导致蛋白过载，需减少上样量；④一抗浓度过高，产生非特异性结合，可降低一抗浓度并延长封闭时间。
①优化封闭条件，延长封闭时间或更换封闭液（如脱脂牛奶换BSA）；②调整一抗孵育条件，降低浓度、缩短孵育时间或提高孵育温度；③增加洗膜次数与时间（用TBST缓冲液充分洗涤），去除非特异性结合的抗体；④选用特异性更高的一抗（如单克隆抗体替代多克隆抗体）。
①确保上样量一致，提前精准测定蛋白浓度并调整样品体积；②检查内参抗体特异性，避免内参蛋白降解；③优化电泳与转印条件，确保蛋白均匀分离与转印；④若内参条带差异过大，需重新提取蛋白并进行实验，保证实验重复性。
