蛋白表达与检测
提供从高灵敏度检测到空间定位分析的全套方案，精准量化目标蛋白的表达水平。
qPCR
实时荧光定量 PCR（qPCR）是在传统 PCR 技术基础上发展而来的核酸定量分析技术，可在 PCR 扩增过程中实时监测荧光信号变化，实现对起始模板核酸的精准定量。qPCR通过追踪PCR反应中积累的荧光信号，实现了对起始模板DNA的精确定量，其核心是Ct值——每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。起始模板量越少，达到阈值所需的循环数就越多，Ct值也越高。该技术突破了传统 PCR 仅能定性或半定量的局限，兼具高灵敏度、高特异性、高准确性及快速高效的特点，能检测到低至几个拷贝的核酸模板。目前 qPCR 已广泛应用于基因表达差异分析、病原体核酸检测、基因工程验证、转基因成分鉴定等多个领域，是分子生物学、医学诊断、农业科研等方向的核心实验技术之一，相较于传统 PCR，其无需后续电泳检测，减少了实验污染风险，且数据重复性与可信度大幅提升。
原理介绍
实时荧光定量PCR（qPCR）的核心是通过荧光信号的实时变化追踪 PCR 扩增进程，实现对扩增过程的实时追踪与定量。根据荧光标记方式的不同，主要分为SYBR Green 染料法和TaqMan 探针法两类，其核心机制如下：SYBR Green 染料法：SYBR Green 是一种能特异性结合双链 DNA 小沟的荧光染料，未结合 DNA 时荧光信号微弱，结合后荧光强度可增强数十倍。PCR 扩增过程中，随着双链 DNA 产物的累积，染料与产物结合量逐渐增加，荧光信号也同步增强，通过监测荧光信号的增长曲线，可实现对模板的定量分析。TaqMan 探针法：在引物之外额外设计一段特异性探针，探针 5' 端标记报告荧光基团，3' 端标记淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团的荧光会被淬灭基团吸收而无法检测；PCR 扩增的延伸阶段，Taq 酶的 5'→3' 外切酶活性会水解探针，使报告基团与淬灭基团分离并释放荧光，荧光信号强度与 PCR 产物量呈正相关，以此实现定量。
文献案例
《Rice》发表题为 “The Mediator Subunit OsMED16 Interacts with the WRKY Transcription Factor OsWRKY45 to Enhance Rice Resistance Against Magnaporthe oryzae.” 的研究论文，通过qPCR确认了中介体亚基基因OsMED16受稻瘟病菌侵染诱导表达；进而通过qPCR分析发现，在Osmed16突变体中，一组负责合成抗菌物质二萜类植物抗毒素的关键基因表达水平显著下降，直接将这些基因的表达缺失与突变体感病表型相关联。在过表达OsMED16的植株中，不仅这些抗毒素基因被强烈诱导，转录因子OsWRKY45及其互作伙伴OsWRKY62的表达也受到影响。结合酵母单杂和ChIP等实验，研究证实OsMED16、OsWRKY45和OsWRKY62形成三元复合体共同结合靶基因启动子，而这一结合的生物学功能最终再次通过qPCR得以验证：该复合体能直接激活下游抗菌物质的生物合成基因。因此，整项研究通过一系列qPCR定量分析，逐步构建出“OsMED16-OsWRKY45复合体通过直接上调抗菌合成基因表达来增强水稻抗病性”的清晰结论，充分体现了qPCR在基因表达定量与功能机制解析中的关键作用。
送样标准
＞0.03g / 份，液氮速冻后 - 80℃保存，干冰运输，避免反复冻融
＞0.1g / 份，液氮速冻后 - 80℃保存，干冰运输
＞0.02g / 份，液氮速冻后 - 80℃保存，干冰运输
＞200μL / 份，-80℃保存，干冰运输，禁止反复冻融
＞1×10⁵个 / 份，PBS 清洗后离心收集，液氮速冻 - 80℃保存，干冰运输
RNA 浓度≥200ng/μL、260/280≈2.0；cDNA 浓度≥50ng/μL，-20℃保存，冰袋运输
交付内容
qPCR 原始数据
包括扩增曲线、熔解曲线原始图谱，各样本及对照的 Ct 值原始记录表；
定量分析结果
绝对定量结果，对于病原体检测等，会直接给出样本中目标核酸的拷贝数或浓度。相对定量结果，对于基因表达分析，常用 ΔΔCt法计算基因表达的变化倍数。最终结果常以柱状图展示处理组相对于对照组（设为1）的表达差异倍数。
实验技术文档
提供引物序列信息、反应体系配方、扩增程序参数，以及数据分析所用软件和方法说明，便于实验重复与数据复现。
常见问题
熔解曲线多峰说明存在非特异性扩增或引物二聚体，可通过以下方式优化：①重新设计特异性更高的引物（避免引物自身互补或交叉互补）；②调整引物浓度（控制终浓度在 0.1-1.0μM）；③优化退火温度（可设置梯度 PCR 筛选最佳温度）；④对 cDNA 模板进行梯度稀释，降低模板浓度过高导致的非特异性结合。
①加样时移液器未校准，导致模板或试剂加样量不均，需定期校准移液器并规范操作；②反应体系配制时未充分混匀，应轻柔吹打或涡旋混匀体系；③qPCR 仪孔位温度不均，可更换仪器或调整样本摆放位置，同时增加生物学重复数量。
SYBR Green 法成本低、操作简便，适合大批量样本的常规定量（如基因表达分析），但特异性相对较低；TaqMan 探针法通过特异性探针实现靶向检测，特异性和准确性更高，适合病原体精准检测、转基因成分鉴定等对特异性要求高的场景，但成本较高且引物探针设计难度大。
