表观组学
解析非序列层面的遗传修饰规律，探索环境如何通过修饰影响基因表达。
M6A-Seq
M6A-Seq（甲基化 RNA 免疫沉淀测序，meRIP-seq）利用特异性抗体富集发生 N6-甲基腺苷（m6A）修饰的 RNA 片段，再进行高通量测序，从而在全转录组范围内鉴定 RNA 甲基化位点，是研究 RNA 表观遗传修饰与应用的重要技术。
原理介绍
MeRIP-seq（Methylated RNA Immunoprecipitation followed by sequencing），也称 m6A-seq，是一种在全转录组范围内检测 RNA 上 N6-甲基腺苷（m6A）修饰位点的技术。m6A 是真核生物 mRNA 和非编码 RNA 中最丰富、研究最广泛的内部化学修饰，参与调控 RNA 的剪接、出核、稳定性、翻译等过程，是研究表观转录组学的关键工具。技术原理：将总 RNA 或 poly(A) RNA 片段化成约 100-200 nt 的小片段，使用抗 m6A 特异性抗体进行免疫沉淀，富集含 m6A 修饰的 RNA 片段；同时取一部分未经免疫沉淀的片段化 RNA 作为 Input 对照。对 IP 和 Input 分别建库测序，比较两者测序读段富集情况，即可在全转录组范围内鉴定 m6A 修饰峰。
实验流程
RNA 提取与片段化
从细胞或组织中提取总 RNA，poly(A) 磁珠富集 mRNA，化学法或酶法（RNase III）随机打断成小片段，用于后续实验
免疫沉淀
片段化 RNA 分成两份，一份与抗 m6A 抗体及 Protein A/G 磁珠共孵育进行免疫沉淀，另一份作为 Input 对照直接保存
洗涤与洗脱
严格洗涤去除非特异性结合的 RNA，用含游离 m6A 核苷的缓冲液竞争性洗脱，或 TRIzol 裂解磁珠提取 RNA，获得目的片段
RNA 纯化
采用RNA Clean试剂盒或磁珠法纯化IP洗脱RNA与Input RNA，去除盐分与杂质，回收高纯度RNA用于建库，保障建库质量。
文库构建与测序
IP与Input RNA分别经去磷酸化、加接头、反转录与PCR扩增构建链特异性文库，质控合格后进行高通量测序，产出高质量原始数据。
生信分析
开展深入全面的数据质控、比对、Peak检测与注释、Motif分析、差异Peak分析及GO/KEGG等功能富集解读，输出完整报告。
送样标准
基因组 RNA、新鲜冷冻组织、培养细胞、植物样本。
提供 ≥ 100 μg 纯净 RNA，去除 RNA 及蛋白残留；RIN > 7；28S:18S > 1.5；OD260/280 1.6–2.3；无明显降解；进行去蛋白和 DNase 处理。
取样量不少于 500 mg，离体后立即用生理盐水清洗、吸干、冰上切块，液氮速冻，-80℃ 保存。
提供不少于 3×10^7 个细胞，PBS 洗涤一次后 600 g 4℃ 离心 5 min 弃上清，液氮速冻，-80℃ 保存。
取幼嫩叶片等富含核酸部位，总量不少于 5 g；多酚或多糖类植物建议增加送样量或提前提取 RNA。
一律干冰运输。
交付内容
序列分析结果
参考基因组比对率、Reads 测序深度累积分布、Reads 在基因上下游/染色体/功能元件上的分布图与统计表；
Peak 检测与注释
Peak 检测结果文件、Peak 在基因组与功能元件上的分布、Peak 相对 TSS 距离分布图；
Peak 相关基因富集分析结果
GO 与 KEGG 通路富集散点图、Top 20 通路列表与差异 Peak 相关基因注释表；
Motif 分析结果
基于 HOMER/MEME 的 m6A 修饰位点周围序列 motif 鉴定结果与 motif 在 Peak 中的位点分布图；
差异 Peak 分析
差异 Peak 结果列表、火山图、差异 Peak 在功能元件上的分布图与统计表；
差异 Peak 富集与 Motif 分析
差异 Peak 相关基因 GO/KEGG 富集结果及 motif 在差异 Peak 中的富集分析；
结题报告
含 IGV 使用说明、方法描述与全部结果附件的 m6A-seq 完整分析 PDF 报告。
常见问题
MeRIP-seq 技术平台同样适用于 m7G、m5C、ac4C 等其他 RNA 修饰的检测，只需更换对应的特异性抗体即可，实验流程与数据分析方法一致。
