lncRNA 测序

长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是一类长度超过200 nt的长链非编码RNA,通过与DNA、RNA或蛋白质结合,在表观遗传、转录及转录后等水平调控基因表达。lncRNA测序针对有参考基因组样本开展准确的lncRNA鉴定和lncRNA靶基因预测,同时提供针对测序数据中mRNA的分析,结果更全面,广泛应用于医学、农学研究领域。

原理介绍

利用高通量测序技术进行lncRNA 测序及生物信息学分析,可快速准确地发现那些具有重要调控功能的lncRNA,分析其与特定生物学过程的关系,深入探索lncRNA的功能及其表达调控机制。包括竞争结合miRNA的ceRNA调控机制,及对染色质结构进行一系列调控如增强子、启动子、绝缘子等。获取Total RNA样本进行rRNA去,cDNA合成(链特异性建库),加入fragmentation buffer将RNA打断成250-300bp短片段,用六碱基随机引物合成一链cDNA。加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase I合成二链cDNA,利用AMPure XP beads纯化双链cDNA。末端修复加接头,纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头,用AMPure XP beads进行片段大小选择,用USER酶降解含有U的cDNA第二链,用AMPure XP beads进行片段大小选择。

文献案例

《Molecular Cancer》期刊上“Integrative Multi-Omics Analysis Reveals the lncRNA 60967.1–PLCD4–ATRA Axis as a Key Regulator of Colorectal Cancer Progression and Immune Response”的研究论文通过多组学分析(转录组、蛋白质组、代谢组)发现lncRNA 60967.1在CRC组织中显著下调,其过表达可恢复肿瘤抑制基因PLCD4的表达,提高全反式视黄酸(ATRA)水平,从而增强IFN-γ诱导的凋亡、增加IFNGR1表达,部分逆转IFN-γ抗性。在小鼠模型中,lncRNA 60967.1过表达促进免疫细胞浸润,与抗PD-1治疗协同抑制肿瘤生长。该研究揭示了lncRNA-代谢物-免疫微环境的调控网络,为CRC免疫治疗提供了新靶点。

lncRNA 测序-文献案例


送样标准

新鲜动物组织干重

内脏组织、脑组织≥0.2g,脂肪、皮肤、骨头、血管等其他组织≥0.4 g。

新鲜植物组织干重

叶片、花≥0.2g,根、茎、种子等其他组织≥0.7 g。

新鲜培养细胞

≥5*106个 。

新采集的全血

≥3ml(EDTA抗凝管) 。

Total RNA建库起始量

总量:≥1ug;浓度:≥50ng/uL。

交付内容

质量控制

对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量reads 的处理,数据产出统计及测序数据的成分和质量评估。

参考序列比对分析拼接

序列拼接组装、IncRNA 筛选、新预测IncRNA 结构特征分析。

表达水平分析

样品间相关性分析、cis 作用靶基因预测。

IncRNA 靶基因预测

trans 作用靶基因预测。

差异分析

差异表达水平分析、GO 富集分析、功能富集分析、KEGG 富集分析、差异表达基因的蛋白互作网络分析、可变剪接分析。

结构分析

融合基因分析、SNP/InDel 分析。

常见问题

哺乳动物基因组序列的约5%~10%被稳定转录,蛋白质编码基因仅约占1%,其余4%~9%的序列都转录为非编码RNA。而非编码RNA(non-coding RNA) 是指不能翻译为蛋白的功能性RNA分子。长链非编码RNA为这4%~9%中长度大于200nt的非编码RNA。它们的作用主要体现在四个方面:第一,影响周边基因的表达;第二,调控蛋白质活动及定位;第三,产生小分子RNA;第四,对其他RNA的调控作用。

要做lncRNA测序分析,对物种有以下要求: a. 物种为真核生物;b. 物种具有参考基因组,至少拼接到scaffold水平;c. 具有较为完整的注释。

可以,关联分析的思路类似于lncRNA 和 mRNA 的关联分析,蛋白质组差异表达蛋白和差异表达 LncRNA 靶基因编码蛋白交集分析(聚类,功能富集)

长链非编码RNA建库主要采用去除rRNA,构建链特异性文库,目前建库比较稳定。适用于人、鼠、动植物等物种。

Tophat和Cufflinks(构建转录本),Infernal(家族分类),CPC(对转录本编码能力进行预测),Blast(比对),SOAP(过滤实验中未去除干净的rRNA,及lncRNA表达定量比对)。

可以,长链非编码RNA建库模式采用去核糖体方式建库,对所获得的RNA进行打断测序,相当于获得全部RNA,即可以进行分析环状RNA表达情况,可应用于分析各物种环状RNA表达谱。

人标品:已知mRNA定量与qPCR定量斯皮尔曼系数达到0.88。

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