外泌体miRNA测序服务-囊泡小RNA表达谱 | Verygenome

外泌体 miRNA 测序

外泌体miRNA测序是针对外泌体中微小RNA（microRNA, miRNA，长度18-25nt的非编码RNA）开展的专项高通量测序技术。miRNA作为基因表达调控的核心分子，可通过靶向mRNA降解或抑制翻译调控基因功能，而外泌体包裹的miRNA凭借囊泡膜保护，能抵御体液中RNA酶的降解，在血清、尿液等体液中稳定性极强，且可通过细胞间通讯将调控信息传递至靶细胞，精准反映源细胞的生理病理状态。与外泌体全转录组测序相比，外泌体miRNA测序聚焦miRNA专项分析，无需兼顾长链RNA，可将测序资源集中于小RNA分子，实现更高的测序深度（≥15M reads）和更精准的低丰度miRNA检出；与组织/细胞miRNA测序相比，外泌体miRNA测序依托无创体液样本，无需侵入性操作，更适合临床动态监测、大样本队列研究及无法获取组织样本的场景。

原理介绍

外泌体miRNA测序的核心原理是外泌体纯化，小RNA富集，专项测序，功能解析。具体流程：外泌体分离与纯度验证，分离外泌体，去除细胞碎片与游离RNA；通过NTA、Western blot、透射电镜三重验证外泌体纯度；外泌体小RNA提取，从纯化的外泌体中提取总RNA，重点保留18-25nt的miRNA片段；去除基因组DNA污染，确保RNA纯度；miRNA专项文库构建，在RNA两端连接特异性测序接头，通过逆转录合成cDNA，再经PCR扩增构建标准化测序文库；高通量测序，采用Illumina NovaSeq/MiSeq二代测序平台，测序深度≥15M clean reads，保障低丰度miRNA的有效覆盖；数据处理与功能解析，过滤低质量reads，将有效reads与人类参考基因组及miRNA权威数据库比对；采用miRanda、TargetScan、PITA等工具预测靶基因，结合GO、KEGG通路富集分析，挖掘差异miRNA的核心调控功能；构建miRNA-mRNA/lncRNA调控网络，解析其在疾病中的作用路径。

文献案例

《Circulation Research》期刊上发表的“Angiogenic Mechanisms of Human CD34+ Stem Cell Exosomesin the Repair of Ischemic Hindlimb”的研究论文，揭示CD34Exo 可独立模拟 CD34⁺干细胞的治疗效果，改善小鼠缺血后肢的灌注、毛细血管密度、运动功能，降低截肢率；而去除外泌体的条件培养基则失去该作用。CD34Exo 富含促血管生成微小 RNA（miRNA），其中 miR-126-3p 是关键成分，敲低该 miRNA 后，CD34Exo 的血管生成活性和治疗效果完全消失。CD34Exo 可直接将 miR-126-3p 转移至缺血组织（不依赖宿主内源性合成），通过抑制靶基因 SPRED1，上调 VEGF、ANG1、MMP9 等促血管生成基因的表达。缺血组织中的内皮细胞对 CD34Exo 的摄取效率最高，CD34Exo 可诱导内皮细胞周期激活和增殖，进而促进血管新生。CD34Exo 通过传递促血管生成 miRNA介导缺血组织修复，为心血管疾病的无细胞治疗提供了新方向。采用的 miRNA 微阵列测序（属于外泌体 miRNA 测序技术）是核心研究工具，筛选差异 miRNA、关联外泌体与母细胞功能、锁定关键功能靶点，是揭示miRNA 介导血管生成机制的前提。

送样标准

体液样本

血清≥5mL；血浆≥5mL；尿液≥10mL；脑脊液≥2mL；唾液≥3mL；

细胞培养上清

≥20mL；

外泌体悬液

≥200μL；

RNA样本

总量≥20ng。

交付内容

原始测序数据

FASTQ格式文件（含原始测序reads），提供MD5校验码确保数据完整性；

数据质量控制报告

外泌体纯度鉴定；RNA质量评估；测序质量评估；

miRNA检测与注释结果

表达量矩阵，miRNA的TPM/RPM表达量数据，包含已知miRNA与新预测miRNA序列信息；差异表达分析：差异miRNA筛选结果（火山图、热图），包含miRNA名称、log2FC、P值、FDR值；数据库注释，miRNA的序列信息、染色体位置、靶基因预测结果；

功能分析结果

GO/KEGG通路富集分析图（Top20富集通路）、miRNA-mRNA调控网络示意图、差异miRNA共表达聚类分析；

分析与解读报告

检测结论，明确核心差异miRNA集合、潜在生物标志物候选名单、与疾病/表型的关联强度；结果解读，核心miRNA的调控机制、外泌体来源细胞推测、临床/研究意义。

常见问题

如何避免游离miRNA与细胞污染对结果的影响？

通过“纯化+质控+数据分析”三重把控：①外泌体纯化采用“超离心+密度梯度离心”组合法，或免疫捕获法（靶向外泌体特异性标志物），结合0.22μm滤膜过滤去除细胞碎片与 aggregates；②Western blot检测Calnexin（细胞内质网标志物，外泌体阴性）排除细胞污染；③数据分析阶段过滤游离miRNA特征（如短于18nt的降解片段占比＜5%），通过外泌体特异性miRNA表达谱聚类分析排除污染样本。

低起始量外泌体RNA是否适合该测序？

适合。外泌体miRNA总量通常为pg-ng级，通过以下方案保障可靠性：①选用小RNA专用高灵敏度提取试剂盒，RNA回收率≥70%；②使用低起始量miRNA文库构建试剂盒（最低起始量5ng总RNA），优化接头连接效率；③提高测序深度至20M clean reads，增强低丰度miRNA覆盖；④数据分析时采用严格的过滤标准，降低假阳性。

外泌体 miRNA 测序数据可用于多中心研究的联合分析吗？如何控制批次效应？

可以，关键在于批次效应控制，核心措施如下：①实验设计阶段：统一样本类型、外泌体分离方法、测序平台及数据分析流程；②样本处理阶段：多中心样本集中统一提取 RNA、构建文库，避免不同实验室操作差异；③数据分析阶段：采用 ComBat、SVA 等工具对表达量矩阵进行批次校正，通过主成分分析（PCA）验证校正效果；④统计分析阶段：将 “批次” 作为协变量纳入差异分析模型，减少批次对结果的干扰。外泌體定量蛋白組

外泌体组学