真核无参转录组测序服务-de novo组装 | Verygenome

无参转录组

真核无参转录组（Eukaryotic De Novo Transcriptome, EDNT）是针对无完整参考基因组或参考基因组质量极低（如组装不完整、注释缺失）的真核生物，通过高通量测序技术对细胞/组织中的mRNA（及非编码RNA）进行系统性测序、从头组装转录本、定量分析与功能注释的核心技术。其核心优势在于无需依赖已知基因组，可直接通过测序数据组装出物种专属的转录本序列，实现基因表达定量与功能挖掘。与真核有参转录组相比，EDNT具有三大核心价值：①物种无限制：适用于稀有物种、新发现物种、基因组未解析物种（如特有药用植物、珍稀动物）；②新转录本挖掘：可发现物种特异性转录本、新基因、可变剪切异构体等未知遗传信息；③自主构建参考：组装的转录组可作为该物种后续研究的“临时参考”，为基因组测序与注释奠定基础。

原理介绍

真核无参转录组的核心原理：样本处理与RNA提取，采用“高完整性RNA富集策略”：①样本破碎；②RNA提取；③质量验证。链特异性文库构建：①RNA片段化；②逆转录；③接头连接；④UDG酶消化；⑤PCR扩增：，富集文库片段。链特异性文库可提升组装准确性，尤其适合非编码RNA注释。高通量测序：采用Illumina二代测序平台，部分复杂物种可结合PacBio三代测序辅助组装。数据分析与功能解析：①数据过滤；②从头组装；③定量分析；④功能注释；⑤高级分析。

文献案例

《PNAS》期刊上发表的"How to upgrade stolen organelles into permanent plastids: A comparative transcriptomic perspective"聚焦于两种硅藻（D. kwazulunatalensis 和D. smirnovii）的次级内共生过程，这两种硅藻均缺乏完整参考基因组。研究团队采用无参转录组测序技术对两种硅藻进行比较转录组分析，鉴定了与叶绿体整合相关的差异表达基因，发现D. kwazulunatalensis 的细胞核基因组发生显著重构，表达完整的己糖磷酸输出通路，表明其与叶绿体的代谢整合程度更深，为理解真核生物次级内共生机制提供了新视角。通过无参转录组从头组装，克服了两种硅藻缺乏参考基因组的限制，实现对次级内共生过程中基因表达变化的系统分析，揭示了叶绿体从窃取细胞器向永久细胞器转化的分子机制。

送样标准

组织样本

动物组织≥50mg；植物组织≥200mg；FFPE组织：≥20张切片（5-10μm），且RNA总量≥5μg。

细胞样本

贴壁细胞：≥2×10⁶个；悬浮细胞：≥3×10⁶个；细胞爬片：≥8张。

体液样本

血清/血浆：≥8mL；脑脊液≥3mL、尿液≥15mL；唾液：≥5mL。

RNA样本

总量≥2μg。

交付内容

原始数据

测序原始文件（FASTQ格式），提供MD5校验码确保数据完整性；测序仪输出报告。

数据质量控制报告

RNA质量评估；测序质量评估；组装质量评估。

unigene组装与注释结果

组装结果；表达量矩阵；差异分析结果；数据库注释，通路归属信息、序列同源性分析结果。

高级分析结果

新基因预测：物种特异性新基因序列与功能注释；SSR标记开发：SSR位点信息；可变剪切分析：剪切事件类型与差异剪切unigene列表；转录因子预测：转录因子家族分类与靶基因关联分析。

分析与解读报告

检测结论：核心差异unigene集合、关键通路富集结果、潜在功能基因/SSR标记候选；结果解读：差异unigene的生物学功能、与物种性状/处理条件的关联、组装转录本的应用价值。

常见问题

真核无参转录组测序（RNA-seq）CDS和ORF的区别?

在真核无参转录组测序中，CDS是编码蛋白质的一段序列，ORF是从起始密码子到终止密码子的一段序列，不是所有的读码框都能表达出蛋白质，也就是说CDS一定是ORF，但ORF不一定是CDS，一般ORF只是理论上的一个编码区，CDS则比较接近实际情况。在预测CDS的时候是先跟数据库比对，比对上的直接提取CDS序列，比对不上的再用软件预测。

组装质量的核心评估指标（如N50、BUSCO）是什么意思？多少算合格？

核心评估指标及合格标准：①N50：将所有unigene按长度从长到短排序，累计长度达到总长度50%时的unigene长度，反映组装片段完整性常规物种N50≥1000bp为合格，复杂物种（多倍体、高重复序列）≥1500bp为优质；②BUSCO：评估组装转录本与近缘物种保守基因的匹配度，反映组装完整性≥70%为合格，≥85%为优质（植物样本≥75%，动物样本≥80%）；③冗余率：重复序列占比≤15%为合格（CD-HIT去冗余后）；④注释率：≥60%为合格，≥75%为优质。

植物样本富含多糖/多酚，会影响无参转录组结果吗？如何处理？

会显著影响：①影响：多糖/多酚会抑制RNA提取效率，导致RNA降解、纯度下降（OD260/230＜1.5），进而降低组装质量（N50下降30%以上）；②处理方案：a. 采样后立即液氮速冻，避免多糖/多酚降解释放；b. 提取时添加PVP（聚乙烯吡咯烷酮）与β-巯基乙醇，结合CTAB法去除多糖/多酚；c. 选用植物专用RNA提取试剂盒；d. 若RNA纯度不达标，通过乙醇沉淀+LiCl纯化进一步去除杂质。

无参转录组的定量准确性比有参低，该如何弥补？

通过“技术优化+实验验证”弥补：①技术优化：a. 采用链特异性文库提升转录本定位准确性；b. 使用RSEM工具进行定量；c. 增加生物学重复，通过统计检验降低假阳性；②实验验证：对核心差异unigene进行qPCR验证，确保表达趋势一致；③数据校正：与近缘物种有参转录组进行同源比对，校正定量结果。

无参转录组组装的unigene可以作为后续研究的“参考基因组”吗？

可作为“临时参考转录组”，但不能完全替代基因组①适用场景：可用于后续基因克隆、表达定量、SSR标记开发等研究，是物种基因组测序前的重要参考；②局限性：unigene是转录本序列，无法反映基因在染色体上的位置、内含子完整信息、非转录区域等基因组特征。

转录组学