DAP-seq测序服务-转录因子结合位点鉴定 | Verygenome

DAP-Seq

DAP-seq (DNA Affinity Purification Sequencing) 是一种高通量测序技术，用于全基因组范围内鉴定 DNA 结合蛋白 (DBP)，特别是转录因子 (TF) 在基因组上的精确结合位点。传统的染色质免疫沉淀测序ChIP-seq 是研究转录因子结合位点的金标准，但它要求有高质量的特异性抗体。对于许多新的或低丰度的转录因子，合适的抗体往往难以获得，这极大地限制了 ChIP-seq的应用。DAP-seq 通过使用体外表达和纯化的融合标签蛋白（如 GST、His 或 FLAG 标签），直接利用其 DNA结合活性来捕获基因组DNA 片段，完全绕开了对特异性抗体的需求。

原理介绍

表达DNA 结合蛋白：将目标DNA结合蛋白（通常为转录因子）的 cDNA克隆到带有亲和标签（如 GST、FLAG）的表达载体中，并在体外（如大肠杆菌或酵母）进行大量表达和纯化。构建基因组DNA 文库：从样本中提取高质量的基因组DNA，随机打断成适当大小的片段（通常 150-300 碱基），并连接上测序接头，构建成一个全基因组DNA文库。体外结合与纯化：将纯化后的标签蛋白与基因组DNA 文库进行体外孵育，使蛋白结合到其特异性的 DNA靶点上。然后，利用针对标签（而非 DNA 结合蛋白本身）的抗体或亲和基团（如 GST 标签使用谷胱甘肽珠），将结合了蛋白的DNA 片段特异性地拉取 (pull-down) 出来。高通量测序：富集后的DNA片段和输入 DNA 文库（对照）分别进行NGS 测序。

文献案例

《Cell》期刊上发表的“O’Malley RC, et al. Cistrome and Epicistrome Features Shape the Regulatory DNA Landscape.” 研究论文利用 DAP-seq 绘制拟南芥 ARF 家族（如 ARF2、ARF5）全基因组结合图谱；系统分析 AuxRE（TGTC）motif 的重复类型（DR/IR/ER）、间距与相位；结合跨物种 DAP-seq（玉米 ARF + 拟南芥/玉米 gDNA）验证结合特异性来源。ARF 偏好结合成对排列的 AuxRE，ARF5 富集于 ~10 bp 间距的直接重复（DR），ARF2 倾向反向重复（IR）；IAA5 启动子含 13 个相位一致的 TGTC 位点，形成超强 DAP-seq 峰；靶基因启动子区 DAP-seq 信号呈周期性富集，暗示与染色质结构协同；ARF 的结合偏好由蛋白自身决定，而非基因组背景。

交付内容

基础分析

原始数据（FASTQ格式，含质量报告），实验条件记录与流程文档，比对率统计与比对文件（BAM格式），Peak calling 结果（BED/narrowPeak格式），Peak 基因组注释（启动子/增强子等分布），基础可视化文件（IGV轨道文件），质量控制报告（实验/测序/结合特异性QC）。

高级分析

差异结合位点分析（多条件比较），Motif 富集分析（MEME/HOMER格式），靶基因功能富集分析（GO/KEGG），多组学数据整合分析（如与RNA-seq联合），调控网络构建，高级可视化（热图、信号趋势图等）。

交付文档

项目总结报告（含实验流程、QC、核心结果与解读）

常见问题

DAP-seq与ChIP-seq有何不同？

核心区别在于蛋白与DNA的来源和相互作用环境。ChIP-seq在活体细胞内进行，捕获的是在天然染色质环境中TF与DNA的结合，但依赖特异性抗体和体内表达。DAP-seq则在体外进行，使用体外表达的TF与裸露基因组DNA互作，无需抗体和体内材料，能更直接地反映TF固有的序列结合特性，并保留基因组DNA的甲基化等化学修饰信息。

为何我的DAP-seq实验背景噪音高或没有特异性峰？

可能原因及对策包括：1）蛋白问题：TF表达量低、失活或标签影响折叠。需优化表达条件、验证蛋白活性。2）DNA问题：gDNA片段大小不合适或有污染。确保片段化至200-300 bp，并使用纯度高、无降解的gDNA。3）结合条件：洗涤不充分或缓冲液条件不佳。增加洗涤严格性，优化盐离子浓度和去垢剂。4）对照设置：必须包含空载体或标签蛋白的阴性对照，以区分非特异性结合。

DAP-seq可以用于研究蛋白质复合物或共因子吗？

可以，但需要策略性设计。标准DAP-seq适用于单个TF。若要研究复合物，可采用：1）共表达：在体外表达系统中同时表达多个亚基。2）预组装：将纯化的不同蛋白在体外混合后与DNA孵育。3）补充因子：在反应体系中加入已知的共因子（如激素、小分子）。这有助于揭示需要伴侣蛋白或修饰才能发挥DNA结合活性的TF功能。

表观组学