CO-IP-MS服务-免疫共沉淀质谱互作分析 | Verygenome

CO-IP-MS

Co-IP-MS（Co-Immunoprecipitation-Mass Spectrometry，Co-IP-MS / IP-MS）是免疫共沉淀（Co-IP）与质谱（MS）联用的核心技术，聚焦蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的系统性鉴定与验证。其核心原理是利用特异性抗体捕获目标蛋白（诱饵蛋白），同时拉取与其直接或间接结合的互作蛋白，再通过高分辨质谱对复合物中的蛋白进行鉴定与定量，最终揭示目标蛋白参与的调控网络。免疫共沉淀或免疫沉淀（Co-IP-MS / IP-MS）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。细胞在非变性条件下被裂解时，细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。用特异性抗体或其他亲和试剂与靶标蛋白的亲和作用，通过免疫共沉淀将靶标蛋白与靶标蛋白的相互作用蛋白从复杂的样本中提取出来，进而进行质谱检测以鉴定靶标蛋白的相互作用蛋白。

原理介绍

Co-IP-MS技术基于免疫沉淀原理，通过特异性抗体捕获目标蛋白及其相互作用伙伴，然后利用质谱分析鉴定这些蛋白质。这种技术能够在复杂的生物样本中准确识别和定量蛋白质以及蛋白质之间的相互作用。具体流程如下：样本预处理与蛋白提取，免疫共沉淀捕获互作复合物、蛋白分离与质谱样品制备、质谱鉴定与数据分析。

文献案例

《Molecular Plant》期刊上发表的“Natural variations of maize ZmLecRK1 determine its interaction with ZmBAK1 and resistance patterns to multiple pathogens”通过全基因组关联分析定位到广谱抗病基因ZmLecRK1，发现其存在抗病（ZmLecRK1Qi319）与感病（ZmLecRK1TY4）两种单倍型。利用Co-IP-MS技术，研究者鉴定到ZmLecRK1的关键互作蛋白——富含亮氨酸的重复激酶ZmBAK1。进一步实验（烟草瞬时表达、玉米原生质体、突变体分析）证实，ZmLecRK1Qi319诱导的细胞死亡及多病原体抗性（蚜蝇、玉米小斑病菌、立枯丝核菌）依赖于ZmBAK1的存在。该研究解析了玉米ZmLecRK1-ZmBAK1互作网络在抗病中的作用，为作物广谱抗病育种提供了分子依据。

送样标准

质粒

≥20ug

大肠甘油菌

≥500uL

种子

粒数≥50 粒

植物组织

Co-IP/IP-MS: 单个样品>3.0g，WB: 单个样品>0.5g；

动物组织

Co-IP/IP-MS: 单个样品>1.0g，WB:单个样品>0.lg

交付内容

原始数据

质谱原始文件（RAW格式）、肽段二级谱图、Co-IP实验原始记录；样本处理全程记录、蛋白电泳图，提供MD5校验码确保数据完整性。

数据质量控制报告

实验质量：Co-IP洗脱产物纯度、肽段回收率；质谱检测质量：肽段鉴定数、蛋白鉴定数、Q30比例、蛋白鉴定FDR；互作筛选质量：诱饵蛋白检出率（100%）、对照组（IgG）非特异性蛋白占比、生物学重复相关性。

互作蛋白鉴定与注释结果

鉴定列表：所有捕获蛋白的名称、分子量、肽段匹配数、序列覆盖率、表达量（Intensity）；差异筛选结果：特异性互作蛋白列表、火山图、热图；数据库注释：互作蛋白功能描述（UniProt）、亚细胞定位、已知互作关系（STRING数据库）、与诱饵蛋白的结合域预测。

功能分析结果

蛋白互作网络：STRING数据库构建PPI网络示意图，标注核心互作节点；通路富集分析：GO/KEGG/Reactome富集散点图（Top20通路），聚焦互作网络参与的核心生物学过程；

分析与解读报告

核心结论：核心特异性互作蛋白集合、互作网络的核心功能、与研究表型的关联；结果解读：关键互作蛋白的生物学意义、潜在的分子机制假设；建议方案：后续验证方向、功能实验设计。

常见问题

如何区分特异性互作蛋白与非特异性吸附蛋白？

通过实验设计和数据分析双重筛选：①实验层面：设置IgG对照组，捕获的蛋白作为非特异性背景；②数据层面：筛选“诱饵蛋白组显著富集（\|FC\|≥1.5、P\<0.05）且IgG对照组未检出/低表达”的蛋白；③功能层面：结合STRING数据库，保留与诱饵蛋白存在已知互作或功能关联的蛋白；④验证层面：通过reciprocal Co-IP进一步确认特异性。

膜蛋白、核蛋白的互作分析，Co-IP-MS实验需注意什么？

针对特殊定位蛋白的专属优化：①膜蛋白：使用含去垢剂的裂解液，维持膜蛋白天然构象；避免高盐洗涤，可添加脂类稳定剂；②核蛋白：采用核蛋白提取试剂盒分离细胞核，用低盐裂解液（10mM Tris-HCl）提取，避免破坏核内蛋白复合物；③抗体选择：优先选择识别蛋白胞内结构域的抗体，避免膜蛋白抗体仅识别胞外域；④验证层面：通过细胞分馏实验确认诱饵蛋白的亚细胞定位，确保提取方法有效。

Co-IP-MS鉴定的互作蛋白，如何通过实验验证其真实性？

分三步进行验证：① reciprocal Co-IP：用候选互作蛋白的特异性抗体进行IP，检测是否能拉取到诱饵蛋白，验证互作的双向性；②免疫荧光共定位：通过激光共聚焦显微镜观察诱饵蛋白与候选互作蛋白在细胞内的共定位，提供空间互作证据；③功能验证：沉默/过表达候选互作蛋白，检测诱饵蛋白的功能变化，验证互作的功能相关性。

Co-IP-MS与酵母双杂交、FRET的核心区别是什么？该如何选择？

核心差异聚焦实验体系、互作类型、适用场景：①Co-IP-MS：体内生理体系，捕获天然互作（直接+间接），适合互作蛋白筛选与鉴定；②酵母双杂交：体外异源体系，仅检测直接互作，适合初筛互作候选；③FRET：细胞内实时检测，验证直接互作并量化结合强度；④选择建议：初筛互作用酵母双杂交，验证并鉴定互作蛋白用Co-IP-MS，量化直接互作用FRET。

蛋白组学