表观组学
解析非序列层面的遗传修饰规律，探索环境如何通过修饰影响基因表达。
CLIP-Seq
紫外交联免疫沉淀结合高通量测序（Cross-Linking and Immunoprecipitation followed by sequencing, CLIP-seq），是一种用于在全基因组水平上研究RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）与其靶标RNA之间相互作用的高通量测序技术。在全基因组范围内高通量、高精度地鉴定RNA结合蛋白与RNA相互作用位点的革命性技术。在传统分子生物学中，研究RNA-蛋白质相互作用多采用RNA免疫沉淀技术，但该方法背景噪音高，无法区分直接结合与间接结合。CLIP-seq通过紫外交联将RNA与蛋白在体内原位“冻结”，形成共价键，从而确保了后续检测到的互作是直接、真实的。它的出现极大地推动了RNA生物学领域的发展，特别是在转录后调控的研究中，已成为不可或缺的工具。
原理介绍
CLIP-seq的核心原理是利用紫外交联将RBP与其结合的RNA在体内瞬间共价交联，随后通过免疫沉淀特异性富集该RBP及其结合的RNA片段，再经过文库构建与高通量测序，最终精确定位RBP在全转录组上的结合位点。
文献案例
《Scientific Reports》期刊上发表"Widespread binding of FUS along nascent RNA regulates alternative splicing in the brain. "研究论文利用iCLIP技术在小鼠脑中绘制FUS全转录组结合图谱，发现FUS沿新生pre-mRNA全长广泛分布，结合模式呈“锯齿状”，提示其在转录早期即结合并伴随剪接完成；其序列偏好极弱，仅轻微富集GGU基序。在FUS敲除小鼠中，多数受调控外显子包含率升高，表明FUS主要抑制外显子纳入。被抑制外显子两侧显著富集FUS结合信号，且与剪接因子U2AF65共定位。尽管FUS与TDP-43结合位点几乎无重叠，二者却共同调控神经发育与神经退行相关基因，揭示其在ALS/FTLD中的平行致病通路。
实验流程
紫外交联与细胞裂解
UV 254 nm 交联 RBP-RNA 复合物，裂解液（含 RNase 抑制剂、蛋白酶抑制剂）超声破碎染色质，保持RNA完整性；
免疫沉淀
抗目标 RBP 特异性抗体与 Protein A/G 磁珠共孵育，4℃ 过夜捕获 RBP-RNA 复合物，严格高盐洗涤去除非特异性结合；
去磷酸化与接头连接
MNase 或 RNase T1/A 适度消化，PNK 去磷酸化，3' 接头与 5' 接头依次连接，为后续反转录与文库构建做好准备；
SDS-PAGE 纯化与蛋白酶 K 消化
RNP 复合物经 SDS-PAGE 电泳分离，切取 RBP 位置上方条带，蛋白酶 K 消化释放 RNA 片段，用于后续建库；
RNA 反转录与文库扩增
反转录为 cDNA，PCR 扩增构建链特异性测序文库，经 Bioanalyzer 评估片段大小分布，质控合格后方可上机测序；
上机测序
Illumina 高通量测序平台 PE150 模式测序，保证 IP 样品 reads 数（推荐 ≥40 M reads/样本）；
生信分析
数据质控（去接头、去污染）、参考基因组比对、Peak 鉴定与注释、Motif 分析、差异结合位点分析、GO/KEGG 富集。
送样标准
- 细胞应处于对数生长期，生长状态良好，无污染。 - 每个实验项目建议提供 ≥3×10⁷ 个活细胞（如 HeLa 细胞约相当于 3 个 15 cm 培养皿），推荐 ≥5×10⁷ 个，以保障后续富集效率。 - 对于核定位 RNA 结合蛋白，建议提供干体积 ≥300 μL 的细胞；对于胞质定位蛋白，建议 ≥100 μL。 - 必须提供至少一管用于预实验验证的样本（约正式量的 1/10），便于评估抗体特异性与结合效率。 - 细胞收集应在 90% 汇合度时进行，避免过度融合影响蛋白活性。 - 收集后立即液氮速冻，-80℃保存，并采用干冰运输。
- 总重量 ≥200 mg，优先使用新鲜组织。 - 取材后立即用冰冷生理盐水冲洗，去除血渍、脂肪及结缔组织等杂质。 - 尽快剪切成小块（≤5 mm³），防止RNA降解。 - 立即投入液氮中速冻至少1分钟，随后转移至-80℃长期保存。 - 运输方式：干冰运输，或置于 Trizol 中干冰运输。
- 推荐选取嫩叶、根尖、幼苗等代谢活跃部位。 - 叶片类组织用无菌水冲洗并擦干水分，锡箔纸包裹后迅速液氮速冻。 - 根茎类组织需剪成小段，装入 1.5 mL EP 管中，立即液氮速冻。 - 建议每种样本准备 2–3 份，以便重复实验或质控使用。 - 运输方式：干冰运输。
交付内容
内部实验质控
片段大小分布图、信噪比评估结果、交联特征（片段长度、UV 交联位点突变）分析报告；
标准分析内容
Peak 识别与注释结果列表、Motif 分析结果、Peak 相关基因 GO/KEGG 功能富集分析；
高级分析
多组间差异结合分析、结合 RNA-seq 数据进行剪接调控整合分析、多组学数据联合分析构建调控网络图。
常见问题
背景噪音主要源于抗体的非特异性吸附及RNA酶的不完全消化。其校正的核心在于必须设置匹配的阴性对照（如IgG或敲除样本），并在生物信息学分析中以此为基础进行背景减除。若无此步骤，将产生大量假阳性峰，导致后续所有基序与功能分析失去意义。
CLIP-seq提供的是交联瞬间的静态结合图谱，无法捕捉RBP结合的顺序性、瞬时性及协同性等动态信息。因此，一个强烈的结合信号可能代表稳定的结构性结合，也可能仅是瞬态的催化性事件。要将结合位点转化为调控机制，必须将CLIP数据与RBP功能扰动后的动态转录组或剪接组变化相结合，以推断因果关系。
